CCK-8檢測細(xì)胞增殖和活力的原理、方法及注意事項(xiàng)

引言

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)研究中的試劑，主要用于簡便而準(zhǔn)確地檢測細(xì)胞增殖和活力。CCK-8基于WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）的還原反應(yīng)，通過生成高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）來反映活細(xì)胞的數(shù)量和活力。本文將詳細(xì)介紹CCK-8檢測細(xì)胞增殖和活力的原理、方法及注意事項(xiàng)。

原理

CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓（1-Methoxy PMS）的作用下，被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。這一還原反應(yīng)與活細(xì)胞的數(shù)量和活力直接相關(guān)，生成的甲瓚物數(shù)量越多，表示活細(xì)胞數(shù)量越多，細(xì)胞活力越強(qiáng)。因此，通過測定甲瓚物的吸光度（OD值），可以間接反映細(xì)胞的增殖和活力情況。

方法

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1. 儀器與試劑：準(zhǔn)備臺式離心機(jī)、細(xì)胞計數(shù)儀、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀（450nm濾光片）、CCK-8檢測試劑盒、DMEM或其他培養(yǎng)基、雙抗、FBS、PBS、DMSO等。

2. 細(xì)胞懸液制備：將對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、計數(shù)，并制備成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 細(xì)胞接種：在96孔板中接種細(xì)胞懸液，每孔約100μL，細(xì)胞數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整，一般貼壁細(xì)胞為3k-7k/孔，懸浮細(xì)胞可適當(dāng)增加。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時（37℃，5% CO2）。

2. 藥物處理（如適用）：向培養(yǎng)板中加入不同濃度的待測藥物或化合物，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間（如6、12、24或48小時）。

3. CCK-8檢測：每孔加入10μL CCK-8溶液，注意避免產(chǎn)生氣泡。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1-4小時。

4. 吸光度測定：使用酶標(biāo)儀在450nm處測定各孔的吸光度（OD值）。

5. 數(shù)據(jù)處理：根據(jù)OD值計算細(xì)胞存活率或抑制率，公式為：細(xì)胞存活率 = [(實(shí)驗(yàn)孔 - 空白孔) / (對照孔 - 空白孔)] × 100%；抑制率 = [(對照孔 - 實(shí)驗(yàn)孔) / (對照孔 - 空白孔)] × 100%。

注意事項(xiàng)

1. 細(xì)胞數(shù)量：細(xì)胞數(shù)量過低會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議預(yù)先摸索合適的細(xì)胞接種數(shù)量。

2. 氣泡干擾：加樣過程中避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會干擾OD值的讀數(shù)。

3. 培養(yǎng)板邊緣孔：培養(yǎng)板最外一圈的孔容易干燥揮發(fā)，建議只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。

4. 藥物影響：如果待測藥物具有氧化還原性，可在加入CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，以去除藥物影響。

5. CCK-8保存：CCK-8試劑應(yīng)保存在4℃或-20℃避光條件下，避免反復(fù)凍融。

6. 波長選擇：對于高渾濁度的細(xì)胞懸液，建議采用雙波長測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

結(jié)論

CCK-8作為一種簡便、快速、準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和活力檢測試劑，在細(xì)胞生物學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用。通過掌握其檢測原理、方法及注意事項(xiàng)，可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。未來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，CCK-8將在更多領(lǐng)域發(fā)揮其重要作用。

參考文獻(xiàn)

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